پايان‌نامه كارشناسي ارشد رشته زيست شناسي سلولي تکويني
مقايسه ي ميزان وقوع آپوپتوزدر بافت بيضه ي موش نابالغ پس از استفاده از دو روش انجماد شيشه اي متفاوت
نگارش
سميرا حاجي آقالو
اساتيد راهنما
دكتر بي‌تا ابراهيمي
دکتر عبدالحسين شاهوردي
شهريور ماه 1393
صورتجلسه ي دفاع
تقديم به
پر ارزش ترين نعمات زندگيم، پدر و مادر نازنينم، آنان که کوشش هايم را ستودند، از پيروزي هايم لذت بردند و در شکست ها همراهم بودند، آنان که احساس وجود پاکشان مايه ي آرامش روح و جان من است
و
برادر و خواهر دوست داشتنيم، که شيريني بخش لحظات زندگيم هستند
تشکر و قدرداني
خداي را شاکرم که به من توفيق کسب علم و معرفت عطا کرد و مرا توانا ساخت تا بتوانم اين دورهي تحصيلي را نيز با موفقيت پشت سر بگذارم
صميمانه ترين سپاس ها نثار بزگواراني که در تمامي مراحل تحقيق و پژوهش پشتيبانم بودند:
استاد گرانمايه سرکار خانم دکتر بي تا ابراهيمي که راهنمايي هاي دقيق و دلسوزانه شان برايم راهگشا بود.
استادگرانمايه جناب آقاي دکتر عبدالحسين شاهوردي که در مسير پژوهش همواره از پشتيباني ها و راهنمايي شان بهره بردم.
از استاد و مدير گروه محترم جناب آقاي دکتر بهاروند که دغدغه ي هميشگيشان آموختن چگونه انديشيدن است.
جناب آقاي دکتر عليزاده و سرکار خانم دکتر صباغيان که داوري پايان نامه ي اينجانب را قبول کردند..
کارشناس محترم آزمايشگاه بيولوژي اسپرم سرکار خانم مينا شربت اوغلي که همواره در تمامي مراحل پژوهش خواهرانه همراهم بود.
از پرسنل محترم پژوهشگاه جناب آقاي اسماعيلي، جان زمين، ساماني، بهروزي و ….
سرکار خانم پرداده، خسرواني، جانان، فاطمي، جهانگيري و …
پرسنل محترم آزمايشگاه جنين شناسي، حيوانات آزمايشگاهي، ناباروري زنان، ژنتيک و اپيدميولوژي …
پرسنل هميشه همراه کتابخانه ي پژوهشگاه رويان جناب آقاي لطفي پناه ، عليزاده و امير فريار
دوستان و همکلاسي هاي عزيزم که وجودشان مايه ي آرامش و شادي بوده وهست.
و تمامي دوستان و عزيزاني که لطف و عنايت ايشان در تمامي مراحل پايان نامه شامل حالم بود.
چکيده
گرچه انجماد بافت بيضه روشي مناسب جهت حفظ باروري در کودکان مبتلا به سرطان است اما القاي آپوپتوز و مرگ سلولي تحت تاثير فرآيند انجماد نکته ي مهمي است که بايد مورد توجه قرار گيرد. هدف از انجام اين پژوهش ارزيابي ميزان آپوپتوز سلولي پس از انجماد شيشه اي بافت بيضه ي موش نابالغ با دو روش انجمادي مختلف و کشت کوتاه مدت آن است.
بافت هاي بيضه از موش هاي سوري نر نابالغ 7 روزه جدا شد و به طور تصادفي در سه گروه کنترل ، انجماديI و انجمادي II تقسيم گرديد. در گروه انجمادي I، بافت ها با استفاده از غلظت هاي افزايشي ضديخ هاي DMSO و EG و در گروه انجمادي II، با استفاده از غلظت افزايشي ترکيب سوکروز و EG منجمد شدند. نمونه هاي انجمادي پس از ذوب همراه با نمونه ها ي کنترل به مدت 20 ساعت در محيط کشت RPMI حاوي 10% سرم KOSR کشت داده شدند. بلافاصله پس ازذوب (ساعت صفر) ،3 و 20 ساعت پس از کشت، مورفولوژي، بقاي سلولي، ميزان وقوع آپوپتوز سلولي و ميزان بيان ژن ها آپوپتوزي (BAX, BCL2,Caspase3, Fas, Fas ligand,P53)، با استفاده از روش هاي ميکروسکوپ نوري، آناليز فلوسايتومتري و Real-Time PCR مورد بررسي قرار گرفت.
روش انجمادي I در مقايسه با روش انجمادي II از لحاظ حفظ يکپارچگي بافت و بقاي سلولي مشابه نمونه ي کنترل بود. آپوپتوز اوليه ي سلولي نيز طي ساعات کشت در گروه هاي انجمادي به طور معناداري (P<0/05) کاهش يافت ولي آپوپتوز ثانويه ي سلولي در گروه هاي انجمادي در ساعت 3 پس از کشت در مقايسه با زمان صفر به طور معناداري (P<0/05) افزايش يافت در حالي که در ساعت 20 پس از کشت در صد سلول هايي که دچار آپوپتوز ثانويه شده بودند در گروه انجمادي I و گروه کنترل در مقايسه با گروه انجمادي II به طور معناداري (P<0/05) بالاتر بود. ميزان بيان ژن BAX در گروه انجمادي I در مقايسه با گروه کنترل در طي ساعات کشت به طور معناداري (P<0/05) بالاتر بود. بيان ژن BCL2 در گروه هاي انجمادي در طي ساعات کشت کاهش يافت ولي اين کاهش معنادار نبود. ژن Caspase3 در همه ي گروه ها در زمان 3و 20 در مقايسه با زمان صفر کاهش معناداري (P<0/05) را نشان داد. بيان ژن هاي Fasو Fas Ligand در ساعت 3 پس از کشت در گروه هاي انجمادي در مقايسه با زمان صفر افزايش معناداري (P<0/05) يافت. ميزان بيان ژن p53 در گروه هاي کنترل و انجمادي I در ساعت 3 و 20 در مقايسه با زمان صفر کاهش معناداري (P<0/05) را نشان داد ولي بيان اين ژن در گروه انجمادي II در طي فرآيند کشت نسبتا ثابت بود.
با توجه به نتايج بدست آمده به نظر مي رسد هر دو روش انجمادي به کار برده شده سبب وقوع مرگ سلولي از طريق مسير نکروزي و آپوپتوزي مي شوند، اما روش انجمادي I در مقايسه با روش انجمادي II مرگ سلولي را بيشتر از طريق آپوپتوز القا مي کند تا نکروز. از سوي ديگر با توجه به تغييرات الگوي بيان ژن P53 در حين فرآيند کشت در هر دو گروه انجمادي مي توان نتيجه گرفت که رخداد آپوپتوز پس از انجماد در بافت بيضه مستقل از ژن P53 است.
کلمات کليدي: بافت بيضه، انجماد شيشه اي، رخداد آپوپتوز
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه11-1-مقدمه21-2-انجماد21-2-1-تاريخچه ي انجماد31-2-2-تکنيک هاي مختلف انجمادي31-2-2-1-انجماد آهسته41-2-2-2-انجماد شيشه اي51-2-3-محلول هاي انجمادي51-2-3-1-ضديخ ها51-2-3-2-سرم71-2-4-تاثيرات انجماد بر بافت بيضه73- 1-3-پيوند94- 1-4-کشت105- 1-5-تغييرات ملکولي متاثر از انجماد111-5-1-آپوپتوزيس121-5-1-1-مسير خارجي آپوپتوز و ژن هاي دخيل در آن131-5-1-2-مسيرداخلي آپوپتوز و ژنهاي دخيل در آن141-5-1-3-P53161-5-1-4-کاسپاز 3171-6-هدف 181-7-پرسش پژوهشي181-8-فرضيات18فصل دوم : مواد و روش ها 192-1-تهيه ي بافت بيضه و گروه هاي مورد مطالعه 202-2-انجماد شيشه اي بافت بيضه212-2-1-روش تهيه محيط پايه212-2-2-روش تهيه محلول هاي انجماد شيشه اي212-2-2-1-روش آماده سازي محلول انجمادي I212-2-2-2-روش آماده سازي محلول انجمادي II222-2-3-مراحل انجماد شيشه اي222-2-3-1-روش انجمادي I222-2-3-2-روش انجمادي II232-2-4-ذوب بافت بيضه232-2-4-1-روش تهيه محلول هاي ذوب232-2-4-2-مراحل ذوب232-5-مطالعات ميکروسکوپي و بافت شناسي بافت بيضه242-6-بررسي آپوپتوز و بقا سلولي262-6-1-هضم مکانيکي و آنزيمي بافت بيضه262-6-1-1-هضم مکانيکي272-6-1-2-هضم آنزيمي272-6-1-3-خنثي سازي اثر آنزيم و بررسي بقا با استفاده از رنگ PI272-6-2-ارزيابي بقاي سلولي به روش فلوسايتومتري282-6-3-بررسي آپوپتوز سلولي292 -7-کشت بافت بيضه302-7-1-آماده سازي آگار302-7-2-آماده سازي محيط کشت312-7-2-1-روش تهيه محيط RPMI312-7-3-کشت بافت بيضه322-8-ارزيابي ژن هاي آپوپتوزي322-8-1-نگهداري بافت در محلول RNA-later322-8-2-استخراج RNA با استفاده از ترايزول322-8-2-1-هموژن کردن بافت
2-8-2-2-مرحله ي جداسازي33
332-8-2-3-رسوب RNA332-8-2-4-شستشو RNA 332-8-3-بررسي کيفي RNA هاي استخراج شده342-8-4-تيمار نمونهيRNA با استفاده از DNase1 جهت حذف آلودگي ژنومي342-8-5-سنتز cDNA352-8-6-پرايمر372-8-6-1-آماده سازي پرايمرها372-8-6-2-بررسي جايگاه اتصال پرايمرها392-8-7-الکتروفورز392-8-7-1-روش ساخت بافر50X TAE392-8-7-2-روش ساخت بافر X TAE1402-8-7-3-طرز تهيه ي ژل آگارز402-8-7-4-بررسي آلودگي پرايمر40-8-7-4-بررسي کيفيت RNA412-8-8-بررسي گراديانت دمايي پرايمر412-8-9 Real-Time PCR422-8-9-2-بررسي کمي بيان ژن با استفاده از روش Real-Time PCR43
2-9-آناليز آماري داده 44فصل سوم: نتايج453-1-بررسي مورفولوژي بافت بوسيله رنگ آميزي هماتوکسيلين و ائوزين463-2-مقايسه بقاي سلولي در گروه کنترل با گروه هاي انجمادي I و II بلافاصله پس از ذوب463-3-بررسي ميزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بيضه473-3-1-ارزيابي ميزان بقاي سلولي طي کشت بافت بيضه473-3-2-آپوپتوز اوليه ي سلولي طي کشت بافت بيضه473-3-3-بررسي ميزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بيضه483-3-4-نکروز بافتي طي کشت بافت بيضه483-4-بررسي بيان ژن هاي آپوپتوزي در سطح رونوشت493-4-1-بررسي بيان رونوشت ژن هاي دخيل در مسير هاي آپوپتوزي493-4-2-Bax493-4-3-BCL2493-4-4-نسبت بيان BAX به BCL2503-4-5-Caspase3503-4-6-Fas503-4-7-Fas Ligand513-4-8-P535127- فصل چهارم: بحث664-1-کليات674-2-بررسي هاي مورفولوژيک در ساعات مختلف کشت در گروه هاي مورد مطالعه684-3-بررسي بقا و آپوپتوز سلولي در گروه هاي مورد مطالعه694-4-بررسي بيان ژن هاي مرتبط با وقوع آپوپتوز در گروه هاي مورد مطالعه714-5-نتيجه گيري754-6-پيشنهادات76
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 2-1-مراحل رنگ آميزي هماتوکسيلين ايوزين26جدول2-2-مشخصات پرايمرهاي مورد استفاده39جدول 2-3-برنامه ي مورد استفاده جهت بررسي گراديانت دمايي پرايمرها42جدول 3-1- ميانگين بقاي سلولي درگروه هاي کنترل، انجمادي I و انجمادي II53جدول3-2- ميانگين بقاي سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادي I و انجمادي II در ساعت هاي مختلف53جدول 3-3- ميانگين درصد آپوپتوز اوليه ي سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادي I و انجمادي II در ساعت هاي مختلف کشت54جدول 3-4-ميانگين درصد آپوپتوز ثانويه ي سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادي I و انجمادي II در ساعت هاي مختلف کشت54جدول 3-5- ميانگين درصد سلول هاي نکروتيک در سه گروه کنترل، انجمادي I و انجمادي II در ساعت هاي مختلف کشت55جدول 3-6-ميزان بيان ژن Bax در سه گروه کنترل، انجمادي I و انجمادي II در ساعت هاي مختلف کشت55جدول 3-7-ميزان بيان ژن BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادي I و انجمادي II در ساعت هاي مختلف کشت5356جدول3-8-نسبت بيان BAX به BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادي I و انجمادي II در ساعت هاي مختلف کشت56جدول3-9-ميزان بيان ژن Caspase3 در سه گروه کنترل، انجمادي I و انجمادي II در ساعت هاي مختلف کشت57جدول 3-10-ميزان بيان ژن Fas در سه گروه کنترل، انجمادي I و انجمادي II در ساعت هاي مختلف کشت57جدول 3-11-ميزان بيان ژنLigand Fas در سه گروه کنترل، انجمادي I و انجمادي II در ساعت هاي مختلف کشت58جدول 3-12- ميزان بيان ژن P53 در سه گروه کنترل، انجمادي I و انجمادي II در ساعت هاي مختلف کشت58
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل 1-1-مسيرهاي شرکت کننده در رخداد آپوپتوز16شکل2-1-ارزيابي بقاي سلولي با روش فلوسايتومتري28شکل2-3-ارزيابي وقوع آپوپتوز30شکل3-1-داده هاي حاصل از آناليز بقاي سلولي با روش فلوسايتومتري در گروه هاي کنترل، انجمادي I و انجمادي II در زمان صفر59شکل3-2-داده هاي حاصل از آناليز آپوپتوز سلولي با روش فلوسايتومتري در گروه هاي کنترل و انجمادي در ساعت صفر60شکل3-3-داده هاي حاصل از آناليز آپوپتوز سلولي با روش فلوسايتومتري در گروه هاي کنترل و انجمادي در ساعت 3 پس از کشت61شکل3-4-داده هاي حاصل از آناليز آپوپتوز سلولي با روش فلوسايتومتري در گروه هاي کنترل و انجمادي در ساعت 20 پس از کشت62شکل 3-5-بررسي مورفولوژيک بافت بيضه در گروه کنترل و گروه هاي انجمادي در زمان صفر بوسيله رنگ آميزي هماتوکسيلين و ائوزين63شکل 3-6-بررسي مورفولوژيک بافت بيضه در گروه کنترل و گروه هاي انجمادي 3 ساعت پس ازکشت بوسيله رنگ آميزي هماتوکسيلين و ائوزين64شکل 3-7- بررسي مورفولوژيک بافت بيضه در گروه کنترل و گروه هاي انجمادي 20 ساعت پس از کشت بوسيله رنگ آميزي هماتوکسيلين و ائوزين65
فصل اول
مقدمه و مروري بر مطالعات گذشته
1-1-مقدمه
به واسطه ي پيشرفت هاي امروزه در زمينهي درمان بيماري سرطان، تعداد افراد بهبود يافته از آن به طور چشم گيري افزايش يافته است، به گونه اي که حدود 80% از کودکان مبتلا به سرطان که تحت درمان بوده اند، سلامتي خود را مجددا به دست آورده اند (1)، ولي با اين وجود حدود يک سوم اين کودکان به دليل حساسيت بالاي سلول هاي اسپرماتوگوني موجود در بيضه، دچار اختلال عملکرد سيستم باروري و ناباروري شده اند (2). بدليل عدم امکان حفظ باروري از طريق انجماد اسپرم در کودکان نابالغ مي توان از انجماد و نگهداري بافت بيضه با هدف پيوند بافت، کشت بافت و يا پيوند سلول هاي آن به عنوان يک استراتژي مناسب جهت حفظ باروري استفاده کرد (3). علاوه بر کودکان مبتلا به سرطان مي توان از اين روش، براي حفظ باروري در افراد بزرگسال (4)، افراد مبتلا به بيماري هاي سيستميک و بيماري هاي خوني (5)، گنادکتومي ها (6)، سندرم کلاين فلتر (7)، کريپتورکيديسم (8) و غيره استفاده کرد. از ديگر مزاياي اين روش حفظ منابع ژنتيکي حيوانات در معرض خطر انقراض است.
1-2-انجماد
انجماد تکنيکي است که به بررسي اثرات دماهاي پايين بر ارگانيسم هاي زنده مي پردازد. يکي از مهمترين کاربردهاي آن، حفظ باروري در انسان و موجودات مختلف است. در روش هاي مختلف انجمادي، نمونه هاي انجمادي در معرض دماهاي بسيار پايين (196- درجه سانتيگراد) قرار مي گيرند. اين دما قادر است بافت انجمادي را در کمتر از يک دقيقه تخريب کند، اما استفاده از غلظت هاي مناسب ضديخ در فرآيند انجماد سبب حفظ و نگهداري بافت انجمادي تا سالهاي متمادي مي گردد. انجماد بافت بيضه در مقايسه با انجماد سوسپانسيون سلولي و يا انجماد سلول هاي اسپرماتوگوني بدليل حفظ تمامي سلولهاي موجود در بافت بيضه، حفظ سلولهاي اسپرماتوگوني در کنام اصلي و نگهداري سلولهاي اسپرماتوگوني و سرتولي در کنار يکديگر و حفظ بر همکنش اين سلولها بر هم بسيار کاربردي و حايز اهميت است.
1-2-1-تاريخچه ي انجماد
گليسرول اولين ضديخي بود که به صورت تصادفي در سال 1949 توسط Polge براي حفظ اسپرم ماکيان استفاده شد (9) و پس از آن پژوهشگران براي انجماد اسپرم گاو و تخمک از آن استفاده کردند (9). با گذر زمان و بهبود روش هاي انجمادي، از ضديخ ها براي حفظ جنين نيز استفاده شد. يک دهه پس از کشف گليسرول به عنوان ضديخ، DMSO1 به عنوان ماده ي انجمادي با خاصيت حفاظتي بالا معرفي شد (10).
مطالعات نشان مي دهند که انجماد بافت، به دليل حفظ عملکرد سلول هدف (براي مثال سلول اسپرماتوگوني در بافت بيضه) که وابسته به ساير سلول هاي موجود در کنام سلولي (براي مثال سلول سرتولي در بافت بيضه) است از اهميت بالايي برخوردار است. اولين بافتي که با موفقيت منجمد شد، بافت تخمدان و با استفاده از ضد يخ گليسرول بود و نتيجهي پيوند پس از انجماد اين بافت نيز اميد بخش بود (11-13). در دههي 1990 مطالعاتي در زمينه ي انجماد و پيوند سلولهاي اسپرماتوگوني انجام شد، که نتيجهي آن شروع اسپرماتوژنزيس سلول هاي اسپرماتوگوني پس از پيوند بود (14-16). تا مدت ها به دليل عدم کاربرد بافت بيضه منجمد شده، بافت بيضه منجمد نمي شد، تا اينکه در سال 2002 انجماد و پيوند موفقيت آميز بافت بيضه انجام شد (17, 18). بنابراين اين علم نو پا بوده و محققين در تلاش براي بهبود روش ها هستند.
1-2-2 تکنيک هاي مختلف انجمادي
محققان روش هاي مختلفي از جمله انجماد سلول هاي زاياي حاصل از هضم آنزيمي بافت بيضه (19) و يا انجماد قطعات کوچکي از بافت بيضه را که حاوي سلول هاي اسپرماتوگوني و سلول هاي سرتولي هستند (20) به منظور حفظ باروري استفاده کرده اند. انجماد بافت بيضه با دو روش انجماد آهسته2 و انجماد شيشه اي3 انجام ميشود. تا مدت ها انجماد بافت بيضه (8, 21, 22) و انجماد سوسپانسيون سلول هاي زايا (19) با استفاده از تکنيک انجماد آهسته انجام مي شد تا اينکه در سال 2011، Curaba و همکارانش انجماد شيشه اي بافت بيضه ي موش را انجام دادند (23). لازم به ذکر است که غلظت ضديخ مورد استفاده، زمان قرارگيري در معرض ضديخ و سرعت کاهش دما در تکنيک هاي مختلف انجمادي با يکديگر تفاوت دارند.
1-2-2-1-انجماد آهسته
انجماد آهسته به عنوان يک روش مناسب براي حفظ بافت بيضه معرفي شده است. در اين روش از غلظت هاي پايين ضديخ (M 2-5/0) به منظور کاهش آسيب سلولي و کاهش اثر سميت ضديخ ها استفاده مي شود، ولي طولاني بودن زمان قرارگيري در معرض ضديخ سبب اعمال اثر سميت ضد يخ بر سلول مي گردد (24). در روش انجماد آهسته وجود ضديخ در محيط انجمادي باعث کاهش سرعت تشکيل کريستال يخ در فضاي برون سلولي و جلوگيري از تشکيل يخ در داخل سلول در حين فرآيند کاهش دما مي شود. تشکيل يخ در محيط خارج سلولي سبب تغليظ محيط انجمادي و ايجاد شيب غلظتي از خارج به داخل سلول شده، که اين حالت باعث آبگيري سلول ها ميشود. آبگيري از سلول ها اثرات مخربي را بر ساختار غشا و ملکول هايي که با ساختار غشا در ارتباط هستند اعمال مي کند و در اين حالت ارگانل ها و ملکول هايي که در شرايط عادي به دليل وجود آب از يکديگر جدا بوده اند به يکديگر نزديک شده و ممکن است به دليل ميانکنش هايي که ميان آنها صورت مي گيرد اثرات تخريبي بر سلول ها اعمال گردد، اين اثر مخرب با نفوذ ضديخ در داخل سلول خنثي مي شود .(25) طولاني بودن مدت زمان قرارگيري سلول ها در معرض ضد يخ و گران قيمت بودن فريزرهاي انجماد آهسته از جمله نقاط ضعف اين روش انجمادي است (26).
1-2-2-2-انجماد شيشه اي در انجماد آهسته، تشکيل کريستال يخ خارج سلولي در ساختار بافتي، موجب آسيب به غشاي سلول و بافت مي گردد. روش جايگزين براي جلوگيري از تشکيل يخ در ساختار بافت تبديل آب به حالت شيشهاي است، در اين حالت با اضافه کردن مقادير بالاي ضديخ به محيط انجمادي، از اجتماع مولکولهاي آب و تشکيل يخ در فضاي خارج سلولي ممانعت شده و نهايتا ميزان آسيب وارده به سلول ها در حين انجماد کاهش مي يابد. بدين ترتيب اغلب سلولها از لحاظ ظاهري سالم هستند و فقط ساعت بيولوژيک آنها متوقف شده است. با وجود آسيب سلولي کمتر در روش انجماد شيشه اي، احتمال آسيب به سلولها در اثر غلظت بالاي ضديخ مورد استفاده همواره بايد مد نظر قرار گيرد (27).
1-2-3-محلول هاي انجمادي
کليه ي محلول ها ي انجمادي ترکيبي از ضد يخ ها، سرم و محيط پايه هستند.
1-2-3-1-ضديخ ها
ضديخ ها به طور کلي به دو دسته ي ضد يخ هاي نفوذپذير و نفوذناپذير تقسيم مي شوند. ضديخ هاي نفوذ پذير داراي قابليت عبور از غشاي سلول بوده و باعث کاهش سرعت تشکيل کريستال يخ در حين سردشدن در داخل سلول ها مي شوند از جمله ضديخ هاي نفوذ پذير مي توان گليسرول، دي متيل سولفوکسيد، اتيلن گليکول4 و پروپانديول5 را نام برد(24, 28). ضديخ هاي نفوذ ناپذير با افزايش ويسکوزيته ي محيط اطراف سلول از تشکيل کريستال يخ در اطراف سلول و آسيب به غشاي سلول جلوگيري مي کنند، دي ساکاريد ها مانند سوکروز6 و ترهالوز7 از جمله ضديخ هاي نفوذ ناپذير هستند (28).
الف: عملکرد ضديخ هاي نفوذ پذير
ضديخ هاي نفوذپذير بواسطه ي خاصيت آبدوستي بالاي خود، با ملکول هاي آب موجود در محيط کشت ميانکنش مي دهند، اين ميانکنش موجب افزايش نفوذ ضديخ به داخل سلول مي شود. وجود ضديخ در فضاي داخل سلول باعث بالا رفتن ويسکوزيته ي مايع درون سلول و کاهش دماي لازم براي تشکيل کريستال يخ در داخل سلول ميگردد، بنابراين استفاده از غلظتهاي بالاي ضديخ، باعث افزايش ويسکوزيته ي داخل سلول، جلوگيري از تشکيل و تجمع هسته هاي يخي و در نتيجه جلوگيري از آسيب غشايي مي شود. خروج آب در حين فرآيند آبگيري از داخل سلول، باعث چروکيدگي سلول و افزايش غلظت نمک ها در داخل سلول مي شود که مي تواند اثرات نامطلوبي بر سلول اعمال نمايد. نفوذ ضديخ به داخل سلول، با رقيق سازي مواد موجود در سلول، سبب جلوگيري از اثرات نامطلوب ناشي از ميانکنش هاي مضر ميان ترکيبات مختلف داخل سلول مي گردد (28).
ب: عملکرد ضديخ هاي نفوذ ناپذير
ضد يخ هاي نفوذ ناپذير مانند ترهالوز و سوکروز با وجود وزن مولکولي بالا نمي توانند به داخل سلول نفود کنند و با افزايش اسمولاريته در محيط اطراف سلول به فرآيند آبگيري کمک کرده و همچنين با افزايش ويسکوزيته ي محيط کشت باعث کاهش دماي تشکيل کريستال يخ در حين انجماد مي شوند (24, 28).
ج: عملکرد مشترک ضديخ هاي نفوذ پذير و ضد يخ هاي نفوذ ناپذير
از جمله ديگر ويژگي هاي ضد يخ ها مي توان حفظ سلامت غشاي دو لايه ي سلول و پروتئين هاي سلولي را نام برد. در اين مورد ضد يخ هاي نفوذ پذير مانند DMSO و ضد يخ هاي نفوذ ناپذير مانند سوکروز ايفاي نقش مي کنند، اين ضد يخ ها با پيوند هاي الکتروستاتيکي که با فسفوليپيد هاي غشا ايجاد مي کنند، باعث حفظ پايداري غشا سلولي مي شوند (26).
1-2-3-2-سرم
سرم در محيط پايه براي حفظ سلول ها، بافت و کاهش اثرات مخرب ضديخ ها مورد استفاده قرار مي گيرد. در گذشته محققان بر اين باور بودند که وجود سرم در محيط انجمادي سلول يا بافت، مانند سلول هاي اسپرماتوگوني (14, 29)، بافت تخمدان (30) و بافت بيضه (31-33) اثرات مثبتي در حفظ نمونه ي انجمادي دارد. در همهي اين تحقيقات ميزان سرم مصرفي 5% تا 20% گزارش شده است. با اين حال پژوهشي که در سال 2013 انجام شد، نشان داد که، افزايش غلظت سرم در محيط انجمادي باعث افزايش بقاي سلولي نمي شود. بنابراين مي توان با کاهش ميزان سرم در محيط انجمادي هزينه هاي مصرفي روش هاي انجمادي را تا حدودي کاهش داد (34).
1-2-4-تاثيرات انجماد بر بافت بيضه
از آنجاييکه انجماد بافت بيضه گزينه ي مهمي در حفظ باروري پسران نابالغ مبتلا به سرطان است، دستيابي به مطلوبترين روش جهت حفظ بافت بيضه بسيار پراهميت است. روش هاي انجمادي بر تماميت بافت بيضه، حفظ و تکثير سلولهاي اسپرماتوگوني، عملکرد سلولهاي محافظت کننده (سرتولي) و بقاي سلول ها تاثير گذارند، از اين رو محققان در راستاي ارزيابي اين اثرات بر بافت بيضه تحقيقات مختلفي را انجام داده اند. Millazo و همکاران با ارزيابي روش هاي مختلف انجمادي، تکنيک انجماد آهسته بوسيله ي ضد يخ DMSO را نه تنها به عنوان تکنيکي موثر براي حفظ ساختار بيضه، بلکه براي حفظ عملکرد بيضه نيز پيشنهاد کردند (33). در سال 2011 آزمايشي در راستاي بررسي اثرات عوامل دخيل در انجماد بافت بيضه انجام شد، اين گروه با بررسي عوامل مختلف دخيل در انجماد (مانند اندازه بافت، نوع ضد يخ، غلظت ضد يخ و…) روش انجمادي مطلوبي را جهت انجماد بافت بيضه رت پيشنهاد کردند. اين گروه بهترين حالت انجماد بافت بيضه را، انجماد بافت بيضه ي5/7 mg موش صحرايي با غلظت 5/1 مولار DMSO پيشنهاد کردند (35). بدنبال آن در سال 2012 ارزيابي هايي که به منظور بررسي تاثيرات سن، حالت نمونه (به شکل بافت و يا سوسپانسيون سلولي) و غلظت ضد يخ مورد استفاده انجام شد حاکي از آن بود که بافت بيضه ي نابالغ در مقايسه با بافت بيضه ي بالغ نسبت به ضد يخ ها حساس تر بوده و انجماد بيضه به صورت بافت، مطلوبتر از انجماد آن به صورت سوسپانسيون سلولي است، چرا که زنده ماني سلولها در انجماد بافت بالاتر از انجماد سوسپانسيون سلولي است. اين تحقيق نيز DMSO را به عنوان ضديخ مناسب براي انجماد بافت بيضه نابالغ وEG را به عنوان ضد يخ مناسب براي انجماد بافت بيضه ي بالغ در انسان پيشنهاد کرد (36). تا به امروز مطالعات مختلفي به منظور مقايسه ي روش هاي انجمادي مختلف انجام شده است، به طوري که در سال 2011 آزمايشي طراحي و انجام شد که در آن 3 روش انجمادي با يکديگر مقايسه شده بودند، علاوه بر آن اثر حالات مختلف بافت بيضه (از لحاظ وجود، عدم وجود و دستکاري تونيکا آلبوجينا و نحوه ي برش بافت) در نتيجه ي انجماد نيز مورد بررسي قرار گرفت. به طوريکه بافت بيضه در 4 حالت، بدون تونيکا، بافت بيضه با تونيکاي دستکاري شده (ايجاد منافذي در تونيکا آلبوجينا به وسيله ي سوزن به منظور نفوذ پذير ساختن بافت جهت نفوذ ضديخ)، با تونيکاي سالم و بافت بيضه اي که به صورت طولي برش خورده بود، تحت انجماد واقع شدند و نتايج نشان داد زمانيکه بيضه بصورت طولي برش مي خورد و يا با سوزن دستکاري مي گردد، ميزان زنده ماني سلولها در مقايسه با دو حالت ديگر بسيار بالاتر است. از طرفي روش انجماد شيشه اي به عنوان روشي بهينه در زمان و هزينه براي حفظ بافت بيضه و سلولهاي اسپرماتوگوني مطرح شد (37). در سال 2012 Baert و همکاران آزمايشي انجام دادند که در آن نرخ موفقيت پس از انجماد شيشه اي و انجماد آهسته در يک سطح نشان دادند، به گونه اي که پس از انجماد شيشه اي فراساختار سلولهاي اسپرماتوگوني، مورفولوژي توبولهاي بيضه اي و عملکرد بافت بيضه اي به خوبي حفظ شده بود (38). اين مطالعات مستنداتي را ارائه کرد که نشان داد تکنيک انجماد شيشه اي روشي ساده، ارزان و مطلوب بوده و مي تواند به عنوان روشي کارآمد جهت حفظ بافت بيضه استفاده شود. Poels و همکاران نيز در سال 2012 با مطالعه اي که در مورد انجماد شيشه اي بافت بيضه و پيوند آن انجام دادند، اعلام کردند که تکثير سلولهاي اسپرماتوگوني و عملکرد سلولهاي لايديگ پس از انجماد شيشه اي و پيوند بافت حفظ مي شود (39). امروزه براي بازيابي باروري پس از انجماد بافت بيضه سه روش آزمايشگاهي: پيوند بافت بيضه ي منجمد شده، کشت و بلوغ آزمايشگاهي بافت بيضه و استخراج، کشت و تمايز سلولهاي اسپرماتوگوني مطرح است.
3-1-3-پيوند
مطالعات in Vivo پس از انجماد بافت بيضه نتايج اميدوار کننده اي را در پي داشت. در انسان پيوند زنوگرفت بافت بيضه ي منجمد شده با روش انجماد آهسته به موش nude پس از شش ماه، حفظ قدرت تکثير و تمايز سلولي را در بافت بيضه ي منجمد و ذوب شده نشان داد. علاوه بر آن، تماميت لوله هاي سمي نفروس در نمونه هاي کنترل، انجماد آهسته و انجماد شيشه اي پيوند شده، به خوبي نمونه هاي تازه ي پيوند نشده حفظ شده بود (40). تنها نقطه ضعف اين مطالعه کاهش چشمگير تعداد سلولهاي اسپرماتوگوني در نمونه هاي انجمادي (آهسته و شيشه اي) و نمونه هاي کنترل پيوند شده بود (40) که آنرا مي توان به نقص در فرآيند پيوند نسبت داد. به نظر مي رسد آنچه سبب کاهش تعداد سلولهاي اسپرماتوگوني پس از پيوند مي گردد تاخير در خون رساني مجدد بافت پيوندي و آپوپتوز سلول ها باشد(41). آپوپتوز فرايندي است که در مراحل ابتدايي پيوند حادث مي شود به صورتي که در سه روزه ي اول پيوند ميزان آپوپتوز در بافت بالا رفته (21) و بتدريج و تا هفتهي سوم ميزان آن کاهش چشم گيري مي يابد (22) و تا ماه ششم نيز روند کاهش آپوپتوز ادامه مي يابد (21). ايسکمي بافت مي تواند باعث آسيب به سلولهاي اسپرماتوگوني، سلولهاي سرتولي، سلولهاي ميوييد، تخريب سيستم خونرساني داخل بافت بيضه و غيره شود که همگي لازمه ي حفظ کنام سلولهاي اسپرماتوگوني هستند (42, 43) در راستاي بررسي حفظ عملکرد سلول هاي موجود در بيضه، Abrishami و همکاران با مطالعه ي انجماد بافت بيضه خوک و پيوند آن به موش نتيجه گرفتند که پس از دو فرآيند انجماد و پيوند، بافت اسپرماتوژنزيس طبيعي خود را از سرگرفته و اسپرماتيد طويل حاصل مي شود (32).
4-1-4-کشت
مطالعات کشت آزمايشگاهي بافت بيضه که از يک سده ي پيش آغاز شده است، پايه اي جهت مطالعهي فرآيند اسپرماتوژنزيس در آزمايشگاه ايجاد کرده است. در سال هاي اخير به منظور بررسي اثرات انجماد بر روي بافت بيضه از کشت Insert استفاده شده است (23). Sato و همکاران در سال 2011 کشت بافت بيضه بر روي آگار را به عنوان روشي مناسبي براي تکميل فرآيند اسپرماتوژنزيس در شرايط آزمايشگاهي معرفي کردند و توانستند با تزريق درون سيتوپلاسمي8 اسپرم هاي حاصل از اين روش، نوزادان موش سالم و بارور توليد کنند.
وجود سرم در محيط کشت براي رشد و تکوين بافت بيضه اهميت دارد و عدم وجود سرم در محيط کشت مانع تقسيم سلولي و رشد قطري لوله هاي سمي نفروس مي شود. کشت بافت بيضه در محيط کشت حاوي سرم و در دماي 34 درجه ي سانتيگراد به عنوان روشي مناسب براي کشت است (44). در مقايسه بين عوامل تغذيه کننده ي بافت بيضه در محيط کشت، 9KOSR در مقايسه با FBS10باعث افزايش شدت اسپرماتوژنزيس و افزايش طول مدت زماني که بافت توانايي اسپرماتوژنزيس را دارد مي شود. محيط هاي کشت 11RPMI و ?-MEM12 باعث تکوين بهتر بافت بيضه ي کشت داده شده مي شوند (44). افزايش غلظت سرم، افزودن هورمون ها و عوامل مختلف به محيط کشت موجب بهبود کيفيت تکوين بافت بيضه نمي شود، چه بسا ممکن است اثرات مخربي نيز در تکوين بافت بيضه داشته باشد (44). Sato و همکارانش در ادامه ي مطالعاتشان در سال 2013 با کشت موفقيت آميز بافت بيضه ي موش نابالغ منجمد شده با روش هاي انجماد آهسته و شيشه اي بر روي آگار توانستند به اسپرماتيد گرد و اسپرم بالغ دست پيدا کنند و از طريق تزريق درون سيتوپلاسمي اسپرم و تزريق اسپرماتيد گرد در تخمک13 توانستند به نوزاد سالم دست يابند (45).
1-5-تغييرات ملکولي متاثر از انجماد
انجماد تکنيکي است که به صورت گسترده و از چندين دهه ي پيش در روش هاي کمک باروري مورد استفاده قرار گرفته است. مطالعات اخير نشان مي دهند که تکنيک هاي انجمادي باعث ايجاد تغييرات ملکولي مانند شکست DNA، حذف، اضافه شدن يا تغيير در بازهاي آلي و ايجاد کراس لينک در ساختار DNA سلول در سطوح مختلف چرخه ي سلولي مانند M ,G2 ,S ,G1 مي شود. از سوي ديگر آسيب DNA در اسپرم موجب باروري ضعيف، اختلال در تکوين جنين، افزايش نرخ سقط و همچنين ايجاد بيماري در نوزادان مي شود(46). انجماد علاوه بر آسيبي که به DNA وارد مي کند باعث کاهش و يا حذف رونوشت برخي از ژن هاي مهم در اسپرم مي گردد که براي لقاح و تکوين جنين حايز اهميت هستند (47). همچنين مشاهده شده که انجماد تيغه ي تناسلي ماهي گورخري14 موجب ايجاد تغييرات نامطلوب در سلول ها و تغييرات ژنتيکي و اپي ژنتيکي در ژن هاي مرتبط با تکوين و تمايز سلول ها مي شود (48). مطالعات نشان مي دهد انجماد (آهسته و شيشه اي) و پيوند بافت بيضه در انسان سبب تغيير در بيان ژن هاي MAGE-A415 (ژن مبين سلول هاي زايا)، 3?-HSD16 (شاخص سلول هاي لايديک) در سطح پروتئين مي شود، ولي در بيان ژن Ki67 (ژن مرتبط با تکثير سلولي) تغييري ايجاد نمي کند (40). همچنين کشت کوتاه مدت بافت بيضه ي موش نابالغ پس از انجماد (آهسته و شيشه اي) افزايش ميزان بيان ژن Ki67 در سطح پروتئين را نشان داد (23). درتحقيقي که در سال 2007 انجام شد، تغييري در بيان ژن ويمنتين (از جمله پروتيين هاي اسکلت سلولي) و CD34 (ازجمله پروتيين هايي که در اتصال سلول ها نقش دارند) در سطح پروتيين پس از انجماد و ذوب بافت بيضه انسان در مقايسه با گروه کنترل مشاهده نشد ولي بيان ژن MAGE-A4 پس از انجماد کاهش داشت (49). اينگونه به نظر مي رسد که تغييرات مذکور در بيان پروتئين هاي مختلف پس از انجماد، پيوند و کشت بافت بيضه با تغييرات ژنتيکي و اپي ژنتيکي در سطح ژن مرتبط باشد.
1-5-1-آپوپتوزيس17
مرگ سلولي توسط مسير هاي مجزا در حين فرآيند آپوپتوز با تغييرات بيوشيميايي مانند فعال شدن کاسپازهاي آغازگر و اجرايي، آزاد شدن سيتوکروم c، قرارگيري مانند نکروز18، آپوپتوز (50) و اتوفاژي19(51) اتفاق مي افتد. آپوپتوز مرگ سلولي است که به واسطه ي تغييرات مورفولوژيک مانند چروکيدگي غشا سلول، متراکم شدن کروماتين، از بين رفتن يکپارچگي غشا هسته، ايجاد حباب در سلول20 و تشکيل اجسام آپوپتوزي21 قابل تشخيص است (52). تغييرات مورفولوژيک فسفاتيديل سرين در نيم لايه ي خارجي، شکست و غيرفعال شدن 22PARP و تشکيل قطعات اينترانوکلئوزمال23 همراه است (53). لزوما تمامي وقايع ذکر شده در تمامي رده هاي سلولي مشاهده نمي شود و با توجه به نوع رده ي سلولي فقط تعدادي از اين اتفاقات در حين آپوپتوز مشاهده مي شود. دوره ي زماني بروز حوادث بيوشيميايي آپوپتوز نيز به عوامل مختلف مانند نوع سلول يا بافت، غلظت مواد مورد استفاده براي تيمار و زمان قرارگيري در برابر عوامل القاگر آپوپتوز که در تيمار سلول يا بافت استفاده شده است بستگي دارد (54, 55). دو مسير عمده که باعث پيشبرد آپوپتوز مي شوند عبارتند از: مسير خارجي يا غشايي24 و مسير داخلي يا ميتوکندريايي25. هر يک از مسيرهاي ذکر شده توانايي اثر گذاري و فعال سازي مسير ديگر را دارند. در بافت بيضه نيز بدليل تقسيمات متوالي ميوز و ميتوز احتمال ايجاد سلولهاي ناکارآمد از لحظ ژنتيکي بسيار زياد است و فرآيند آپوپتوز در بافت بيضه باعث از بين رفتن چنين سلولهايي مي شود (56).
1-5-1-1 مسير خارجي آپوپتوز و ژن هاي دخيل در آن
فعال سازي مسير خارجي در نتيجه ي اتصال عامل مرگ(CD95, Fas ligand, …) به گيرنده مرگ(Fas, …) است. ابتدا عامل مرگ به گيرنده ي مرگ متصل شده و با سه تايي شدن26 گيرنده ي مرگ و فعال سازي کاسپاز 8 مسير غشايي آپوپتوز آغاز مي شود. کاسپاز 8 مي تواند به شکل غيرمستقيم و با شکستن و فعال سازي پروتيين Bid باعث رخداد آپوپتوز از طريق مسير ميتوکندريايي شود. کاسپاز 8 فعال سبب فعال شدن کاسپاز 3 و7 مي شود که نتيجه ي آن فعال شدن و غيرفعال شدن پروتئين هاي هدف در داخل سلول است (شکل 1-1).
در سال 2010 اثرات انجماد در بيان ژن هاي آپوپتوزي Fas/Fas ligand بررسي شد، در اين آزمايش ارزيابي هاي ايمونوهيستوشيمي براي بررسي بيان اين دو ژن حاکي از عدم بيان ژنها پيش از انجماد و بيان اين ژنها پس از انجماد در فوليکولهاي بدوي تخمدان با ظاهر سالم بود (57).
Fas/Fas ligand پروتئين هايي هستند که در بيضه نيز بيان مي شوند (58). در اولين موج اسپرماتوژنزيس موش صحرايي بيان ژن Fas افزايش مي يابد (59) و موش هايي که فاقد بيان ژنFas ligand هستند به دليل عدم رخداد مسير خارجي دچار افزايش وزن بيضه مي شوند (60). در انسان نقش ژن هاي Fas/Fas ligand در آپوپتوز سلول هاي موجود در بافت بيضه مشخص شده است. بيماري هايي مانند توقف بلوغ اسپرم27و سلول هاي سرتولي تنها28در نتيجه ي افزايش Fas ligand و فعال شدن مسير آبشاري خارجي و مرگ وسيع سلولي در بيضه ايجاد مي شوند (61). گرچه تيمار سلول هاي زاياي بيضه با هيدروژن پراکسيد باعث افزايش چشم گير بيان ژن هاي Fas/Fas ligand در سطح mRNA ميشود، ولي افزايش معناداري در بيان اين ژن در سطح پروتيين ايجاد نمي کند (62). بررسي بيان ژن Fas در سلول هاي زاياي بيضه ي موش پس از انجماد شيشه اي نشان داد که ميزان بيان ژن Fas پس از انجماد در مقايسه با سلول هاي زاياي گروه کنترل کاهش مي يابد (63).
1-5-1-2-مسيرداخلي آپوپتوز و ژنهاي دخيل در آن
مسير داخلي در سلول هايي فعال مي شود که هموستاز سلولي در آنها تحت تاثير عواملي مانند گونه هاي آزاد اکسيژن، جداشدگي از غشا پايه، حرارت، کمبود اکسيژن، اشعه ي گاما، آسيب DNA و عدم وجود فاکتورهاي حفاظت کننده ي سلولي، از بين رفته است. اين مسير تحت کنترل پروتئين هاي خانواده ي BCL2 است (شکل 1-1). از جمله پروتئين هايي که باعث پيشبرد آپوپتوز مي شوند، BAX BAD,BOK,و BAK هستند. BCL2,BCL-xl از جمله پروتيين هاي ممانعت کننده از وقوع آپوپتوز از طريق مسير ميتوکندريايي هستند. بر هم خوردن تعادل بين عوامل موافق و مخالف آپوپتوز باعث تغيير در نفوذ پذيري غشاي ميتوکندري و آزاد شدن سيتوکروم c از فضاي بين دو غشا مي شود. سيتوکروم cبه همراه پروتيين 29APAF-1 و کاسپاز 9 باعث تشکيل کمپلکس آپوپتوزوم شده و نهايتا باعث فعال سازي کاسپاز 9 مي شود، کاسپاز 9 نيز با فعال کردن کاسپاز 3 باعث رخداد آپوپتوز مي گردد (64).
مطالعات نشان مي دهند که طي دوران جنيني مسير ميتوکندريايي باعث مرگ و حذف سلول هاي زاياي اضافي مهاجرت کننده به گناد مي شود(55, 56). موش هاي ترانس ژن که قادر به بيان ژن Bax نيستند يا بيان ژن BCL2 در آنها بيش از حد معمول است به دليل تجمع سلول هاي اسپرماتوگوني در بيضه دچار ناباروري مي شوند (65). تيمار سلول هاي زاياي بيضه موش صحرايي با غلظت هاي بالاي هيدروژن پراکسيد موجب بر هم خوردن تعادل ميان عوامل موافق و مخالف آپوپتوز و در نتيجه مرگ برنامه ريزي شده ي سلول ها مي شود (62). در سال 2013 مطالعه ي اثر انجماد شيشه اي بر



قیمت: تومان


پاسخ دهید